ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НОВОГО ВИДА ДЛЯ САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ ЗЕЛЁНОЙ ВОДОРОСЛИ HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS НА ПЕРЕХОД ИЗ ГЕМИМОНАДНОЙ В МОНАДНУЮ СТАДИЮ

Полный текст

При анализе перифитонных организмов на дачном участке в селе Новосемейкино в октябре 2020 года нами был обнаружен новый для Самарской области вид зелёной водоросли Haematococcus pluvialis. На момент изучения он представлял собой крупные, неподвижные, шарообразные, красные клетки с гематохромом в гемимонадной стадии. Известно, что в неподвижной (гемимонадной) стадии он пережидает неблагоприятные условия, а в подвижной (монадной) стадии он активно размножается и накапливает биомассу.

Систематическое положение. Haematococcus pluvialis Flotow [1] находится в царстве Chloroplastida и относится к отделу Chlorophyta [2].

Данная микроводоросль является наилучшим природным источником астаксантина. В её клетках до 80% гематохрома, в котором содержится астаксантин, применяющийся в данных направлениях:

– БАД;

– лекарственные препараты;

– косметические средства;

– корм/кормовая добавка для животных (например, лосось, фламинго и креветки).

Из-за его способности накапливать большое количество астаксантина, Haematococcus pluvialis достаточно активно изучается по всему миру, например, в Китае. За рубежом он достаточно хорошо изучается и культивируется. Так в базе данных PubMed Central.org мы нашли 1717 статей с его упоминанием [3].

 

Методы исследования.

Для перехода H. pluvialis в подвижную монадную стадию, мы исходя из возможностей, приготовили две среды (BBM-1, BBM-2), которые на наш взгляд больше всего подходят для «пробуждения» клеток гематококка.

Поместив небольшие образцы в колбы со средами (по три колбы на среду), закрыли их ватными пробками и культивировали при освещённости 400–500 ЛК при комнатной температуре (примерно 18–20 °С), цикл света и тьмы 12:12 соответственно (позже 16:8). 

Результаты и их обсуждения.

Через 4 дня в среде BBM-1 есть клетки мелкие до 10 мкм в диаметре, таких клеток 40% от общего количества, содержимое светло-зелёное зернистое (рис.1). В крупных клетках с диаметром более 40 мкм начинается процесс исчезновения астаксантина с периферии клетки к центру, таких клеток около 25% (рис.2). Оставшиеся 35% клеток – это зелёные клетки средней величины 25 мкм в диаметре.

Рис. 1 H. pluvialis на 4 день культивирования                             

Рис. 2 H. pluvialis на 4 день культивирования                                                 

В среде BBM-2 в 50% клеток мы видим исчезновение гематохрома и проявление ярко-зелёного хроматофора с зернистой структурой (рис.3). В других клетках гематохром занимает чётко ограниченное положение с краю клетки (рис.4). Единичные более крупные клетки пока остаются равномерно красными.

Рис. 3 H. pluvialis на 4 день культивирования                             

Рис. 4 H. pluvialis на 4 день культивирования

                        

Следует отметить, что в двух изучаемых нами средах, достаточно похожих по составу, морфологические изменения разные на данном этапе культивирования.

Спустя девять дней культивирования различия становятся минимальными, и в обеих средах 95% особей становятся зелёными, но монадных форм пока не обнаружено.

Рис. 5 Общий вид образца на 9 день культивирования

Рис. 6 Клетки H. pluvialis в среде BBM-1 на 9 день культивирования       

Рис. 7 Клетки H. pluvialis в среде BBM-2 на 9 день культивирования                                     

На 26 день в колбе BBM-1 была обнаружена монадная стадия в длину 10 мкм, в ширину 8 мкм. Внутри чёткий пиреноид и чашевидный хроматофор.

Кроме неё остаются автоспоры, все зелёные, но есть и мёртвые бесцветные (рис.8). Наблюдаются также поделённые ярко-зелёные клетки по 6 шт. за деление (рис.9).

Рис. 8 Клетки H. pluvialis в среде BBM-1 на 26 день культивирования         

Рис.9 Клетки H. pluvialis в среде BBM-1на 26 день культивирования

В другой колбе со средой BBM-1 есть единичные ярко-красные клетки. В образце в каждой клетке появляется гематохром, возможно условия культивирования стали несколько хуже.

Рис. 10 Клетки H. pluvialis с проявлением гематохрома в среде BBM-2 на 26 день культивирования

Через 33 дня в одной из 6 колб со средой BBM-1 наблюдается активный переход в монадную стадию Haematococcus pluvialis, с численностью до 1–2 клетки в одном поле зрения в толще воды, что придаёт однородный жёлто-зелёный цвет среде. Также наблюдаются и мёртвые клетки (рис.11).

Рис. 11 Клетки H. pluvialis в среде BBM-2 на 33 день культивирования

Спустя 10 месяцев культивирования изменения были следующие.

Монадная форма снова стала гемимонадной, возможно из-за сезона жаркого лета условия ухудшились и Haematococcus pluvialis вновь стал апланоспорой, но без образования гематохрома. Оставаясь в гемимонадном виде H. pluvialis продолжал митотически делиться. Но, к сожалению, из-за того, что культура не чистая, количество его клеток возросло несильно, т.к. такие микроводоросли как Scenedesmus sp. делятся более активно.

На 10 месяц культивирования Haematococcus pluvialis стал более активно делиться митозом (рис.12) и увеличиваться в размерах, вновь достигая 40 мкм в диаметре (рис.13). Скорее всего это связано с тем, что в зимний сезон яркость достаточно понижена, чтобы не переходить в стадию гематоцисты. В то время как, для других видов микроводорослей она слишком низкая для активного размножения.

Рис. 12 Клетки H. pluvialis в среде BBM-2 через 10 месяцев культивирования

Рис. 13 Клетки H. pluvialis в среде BBM-2 через 10 месяцев культивирования

Заключение.

Наблюдая за культивированием Haematococcus pluvialis можно сказать, что данная микроводоросль достаточно чувствительная к сезонным переходам, а именно к естественному освещению. Также опытном путём доказано, что H. pluvialis не является доминирующим видом в смешанной с другими видами среде. При культивировании, когда среда от 150 мл достигала отметки в 100 мл, мы подливали газированной воды, для своеобразного барботирования культуры. После подливания, клетки делились активнее, что указывает на то, что наличие CO₂ в среде благотворно влияет на рост и развитие всех водорослей, включая Haematococcus pluvialis.

Обобщая данные по культивированию на жидкой питательной среде, нам пока, к сожалению, не удалось получить чистую культуру, так как другие сопутствующие изучаемому нами виду размножаются активнее, чем Haematococcus pluvialis, что приводит к засорению культуры.

Для получения чистой культуры необходимо взять под микроскопом отдельные клетки Haematococcus pluvialis и поместить их в стерильную питательную среду.

Сейчас мы можем сделать лишь предварительные выводы, так как работа находится ещё в начале.

1. Среда BBM подходит для культивирования Haematococcus pluvialis.
2. Для перехода из гемимонадной в монадную стадию подходит питательная среда ВВМ-1, а для накопления биомассы – BBM-2.

В дальнейшем мы планируем выделить чистую культуру водоросли, а также продолжить изучение необходимых условий не только для его активного роста, но и для усиленного накопления в нём астаксантина, и после разработать способы наилучшего извлечения и применения активного действующего вещества.

Об авторах

Анастасия Касьянова

Самарский национальный исследовательский университет имени академика С.П. Королёва

Автор, ответственный за переписку.
Email: anastasiakasyanova22@mail.ru
Россия

Евгений Сергеевич Корчиков

Самарский университет

Email: evkor@inbox.ru
443086, Россия, г. Самара, Московское шоссе, 34

Список литературы

Дополнительные файлы