ПРИГОТОВЛЕНИЕ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЕЙ И ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ КОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ ГЕЛЕЙ И ГЕЛЬ-ПЛЁНОК БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ


Цитировать

Полный текст

Аннотация

В работе представлены результаты получения гелей и «вторичных» гель-плёнок бактериальной целлюлозы при культивировании Gluconacetobacter sucrofermentans и использование их в качестве носителей антибактериальных и иммуностимулирующих препаратов. Впервые в качестве носителей биологически активных соединений использованы гели и «вторичные» гель-плёнки. Полученные результаты показали высокую эффективность использования «вторичных» гель-плёнок как носителей антибактериальных, антифунгальных, иммуностимулирующих препаратов. Антибактериальное действие обнаружено по отношению к грамположительным бактериям (стафиллококки, более выраженный эффект) и грамотрицательным бактериям (кишечная палочка), антифунгальное действие получено по отношению к штамму Aspergillus flavus.

Полный текст

Бактериальная целлюлоза (БЦ) в ближай- шем будущем может стать одним из самых пер- спективных материалов для получения компо- зитов для применения в медицине, промыш- ленности и других отраслях. Благодаря уни- кальной величине и укладки волокон полимера БЦ многими исследователями относится к наноматериалам. Наличие мелких пор, природ- ная чистота, гипоаллергенность, малая адгезия к поверхности кожи позволяют успешно ис- пользовать БЦ в качестве органической мат- рицы при создании композитов путём внесения в гель-плёнки и гелей эффективных антибакте- риальных и биостимулирующих компонентов. Целью данной работы стало получение композитов на основе гелей и «вторичных» гель-плёнок с добавлением растительных экс- трактов и антибиотических компонентов. Условия и методы исследований В качестве продуцента бактериальной целлюлозы нами была использована культура Gluconacetobacter sucrofermentas H-110. Штамм депонирован во Всероссийской Кол- лекции под регистрационным номером ВКПМ В-11267 и любезно предоставлен нам кафедрой биотехнологии, биоинженерии и биохимии Мордовского государственного университета имени Н. П. Огарева. Для получения гелей была использована среда Grande (2009). Культивирование осу- ществляли в шейкере-инкубаторе (Environ36 Биология mental Shaker-Incubator ES-20/60) в течение 5-ти суток при температуре 30 ᴼС и скоростью перемешивания 250 об/мин. Полученные гели промывали в дистиллированной воде, затем помещали в 0,1 Н раствор NaOH для очистки от оставшихся клеток на 30 минут, затем про- мывали дистиллированной водой, помещали в 0,5 % раствор HCl на 30 минут и снова про- мывали дистиллированной водой до нейтральной реакции [1]. Гели максимально освобождали от воды методом стекания через воронку с носиком малого диаметра, смеши- вали с 96 %-ным этиловым спиртом 1:1 по объёму и хранили при температуре 10-12 ᴼС. В качестве иммуностимулирующих и антибактериальных компонентов мы исполь- зовали спиртовые экстракты календулы и алоэ. Данные растения давно используются в медицинской практике. Препараты кален- дулы применяют как дезинфицирующее бак- терицидное средство против некоторых воз- будителей болезней, особенно против пред- ставителей родов стафилококков и стрепто- кокков. Лечебные свойства календулы лекар- ственной основаны на содержании в сырье комплекса биологически активных веществ: каротина (провитамина А), стеринов, тритер- пеноидов, флавоноидов, эфирных масел, ку- маринов, макро- и микроэлементов и других. Сок алоэ обладает бактерицидным и бакте- риостатическим действием в отношении мно- гих групп микробов: стрептококков, стафил- лококков, дифтерийной, брюшнотифозной и дизентерийной палочек. Алоэ обладает мощ- ными ранозаживляющими свойствами, повы- шает иммуннореактивные способности орга- низма, а также является великолепным био- стимулятором. Листья и сок алоэ древовид- ного содержат антропроизводные: алоин, изо- барбалоин, рабарберон, ферменты, вита- мины, фитонциды, следы эфирных масел и ряд минеральных веществ (К, Са, Сu, Mg, Ba, Zn, Li) и другие биологически активные ве- щества. Спиртовые экстракты календулы и алоэ готовили по аптечной рецептуре: экстрагиро- вали 70 %-ным этиловым спиртом (для кален- дулы - 1 г сухих цветков на 10 мл спирта; для алоэ - 1 мл сока алоэ на 2 мл этилового спирта), фильтровали через 2-3 слоя марли, хранили в тёмной посуде и защищённом от света прохладном месте в течение 7-ми суток. Для получения композитов «вторичных» гель-плёнок в гель добавляли экстракты кален- дулы или алоэ в соотношении 1:1. В качестве контроля использовались гели с добавлением 96 % этилового спирта в соотношении 1:1. По- сле тщательного перемешивания композиты распределяли тонким слоем по полиэтилено- вой плёнке и сушили в кристаллизаторе при комнатной температуре до постоянного веса. На часть «вторичных» гель-плёнок наносили 0,5 % раствор хлоргексидина в ко- личестве 10 мкл на каждый образец, площа- дью 0,25 см2 после помещения его на свежие посевы бактерий. Композит геля бактериальной целлю- лозы с экстрактами, хлоргексидином и диме- тилсульфоксидом (DMSO) содержал 33 % экстракта, 16 % хлоргексидина и 3 % DMSO. Полученные композиты гелей бактери- альной целлюлозы с экстрактом, хлоргекси- дином и DMSO формировались в виде шаро- видных образцов с помощью пинцета и стек- лянных палочек. В качестве контроля исполь- зовались гели с добавлением 96 % этилового спирта в концентрации 52 %. В качестве антибактериального соеди- нения использовали поли-N,N-диметил-3,4- метиленпирролидиний хлорид в виде про- зрачного 15 %-го водного раствора светло-ко- ричневого цвета, имеющего специфический запах. Поли-N,N-диметил-3,4-метиленпирро- лидиний хлорид (полиаллилдиметиламмония хлорид, ПАДМАХ) синтезирован в Инсти- туте химической физики РАН под руковод- ством академика РАЕН, д.х.н., профессора М. И. Черкашина. Раствор полимера был предоставлен фирмой «Формула АГРЭКО». Препарат устойчив к действию высоких тем- ператур, фотолизу и гидролизу. Он обладает малой токсичностью по отношению к живот- ным и человеку (LD50 для крыс - 5560 мг/кг). Минимальная бактерицидная концентрация по отношению к псевдомонадам и ксантомо- надам составляет около 150 мкг/мл Молеку- лярная масса поли-N,N-диметил-3,4-метилен- пирролидиний хлорида при полимеризации составляла 100-150 тыс. Да, рН 7-8, плот- ность 1,03-1,05 г/см3 при 20 °С [2; 3]. Воздей- ствующие концентрации ПАДМАХа гото- вили разведением 15 % раствора в 2 (7,5 %), 4 (3,75 %) и 5 (3 %) раз дистиллированной во- дой и смешивали с гелем в отношении 1:1. Вестник молодых учёных и специалистов Самарского университета. 2018. № 2 (13) 37 Также был использован 2-амино-6-нит- робензотиазол - гетероциклическое органи- ческое соединение, зарегистрированное под номером CAS 6285-57-0. Соединение пред- ставляет собой жёлтое кристаллическое ве- щество, хорошо растворимое в этаноле. При- меняется в химической промышленности и для исследовательских целей [4; 5]. Вещество было синтезировано на кафедре органиче- ской, биоорганической и медицинской химии Самарского национального исследователь- ского университета имени академика С. П. Королева кандидатом химических наук, доцентом Ермохиным В. А. из соответствую- щего производного фенилтиомочевины по методу Хугерсхофа [5]. Для получения «вторичной» плёнки на основе геля БЦ и 2-амино-6-нитробензотиа- зола навеску 50 мг 2-амино-6-нитробензотиа- зола растворяли в 5-ти мл 96 %-ого этилового спирта. Полученный раствор помещали в 10 мл геля, перемешивали в шейкере-инкуба- торе (Environmental Shaker-Incubator ES- 20/60) 20 минут, режим перемешивания - 250 об/мин. Полученную смесь выкладывали в чашку Петри на полиэтиленовую плёнку, оставляли до высыхания. Полученные образцы «вторичных» гель-плёнок перед использованием подверга- лись стерилизации с помощью УФ-облучения или термообработки горячим или сухим па- ром, гели предварительной стерилизации не подвергались с целью сохранения первичного состава. В качестве тест-объектов были исполь- зованы бактериальные культуры Escherichia coli (E. coli) M-17 и Staphylococcus epidermidis NCTC8325-4. Для посевов использовали су- точные инокуляты в минеральной среде Чапека с плотностью популяций от 0,15 до 0,44 единиц оптической плотности (λ = 670 нм, толщина поглощающего слоя 0,5 см). Для изучения антифунгальной активности те- стовым микроорганизмом послужил Aspergillus flavus, штамм был выделен из почвы с ис- пользованием подкисленной среды Чапека. Гриб-сапротроф из рода Aspergillus распро- странён повсеместно - в почве, воде, воздухе, старых книгах, перьевых подушках, кондици- онерах и увлажнителях воздуха. Об антибактериальном действии судили по зонам отсутствия роста вокруг образцов после односуточного или 2-3-х суточного ро- ста на мясо-пептонном агаре при температуре 30 ᴼС. Антифунгальное действие фиксиро- вали после 3-х суточного роста на подкислен- ной среде Чапека. Результаты и их обсуждение «Вторичные» гель-плёнки с добавле- нием экстракта алоэ не характеризовались высоким антибактериальным эффектом, как по отношению к E. coli, так и по отношению к Staphylococcus epidermidis. Рост не наблю- дался только непосредственно под образ- цами. При добавлении во «вторичные» гель- плёнки с экстрактом алоэ 10-ти мкл хлоргек- сидина наблюдается значительный антибак- териальный эффект, выражающийся в увели- чении зон ограничения роста примерно в 4 раза как по отношению к E. coli, так и по от- ношению к Staphylococcus epidermidis. Использование гелей, содержащих только этиловый спирт не эффективно по от- ношению к E. coli, однако даёт значительные зоны ограничения роста Staphylococcus epidermidis. Гель с добавлением экстракта алоэ, хлоргексидина и DMSO более эффекти- вен по отношению к Staphylococcus epidermidis, чем по отношению к E. coli. Зоны ограничения роста при использовании в каче- стве тест-объекта Staphylococcus epidermidis приблизительно в 2 раза больше, чем при ис- пользовании в качестве тест-объекта E. coli. При использовании в качестве носителей «вторичных» гель-плёнок добавление экс- тракта календулы предотвращает рост E. coli только под образцами, зоны ограничения роста вокруг образцов нет. При использовании кон- трольных образцов «вторичных» гель-плёнок наблюдается полное зарастание чашек, вклю- чая область образцов. Ту же закономерность мы наблюдали и в случае использования в ка- честве тест-объекта инокулят Staphylococcus epidermidis. Если же на образцы «вторичных» гель-плёнок, содержащих экстракт календулы, наносили водный раствор хлоргексидина, то наблюдали появление значительных зон огра- ничения роста бактерий (табл. 1). Эффект огра- ничения роста был наиболее выражен по отно- шению к Staphylococcus epidermidis. Диаметр зон отсутствия роста оказался выше на 30 %, чем у E. coli (табл. 1). 38 Биология Таблица 1 Антибактериальное действие гелей и «вторичных» гель-плёнок, содержащих растительные экстракты, хлоргексидин и диметилсульфоксид Характер и состав композита Зоны отсутствия роста, мм Escherichia coli Staphylococcus epidermidis А) «Вторичнаяё гель-пленка с этиловым спиртом (кон- троль); Б) Гель с этиловым спиртом (контроль) нет нет нет 14,30±2,04 А) «Вторичная» гель-плёнка с экстрактом алоэ; Б) «Вторичная» гель-плёнка с экстрактом календулы 5,00 ± 0,13 5,00 ± 0,13 5,00 ± 0,13 5,00 ± 0,13 А) «Вторичная» гель-плёнка с экстрактом алоэ + 10 мкл хлоргексидина; Б) «Вторичная» гель-плёнка с экстрактом календулы + 10 мкл хлоргексидина 18,20 ± 1,95* 18,70 ± 2,13 20,50 ± 1,75* 24,60 ± 1,18*^ А) Гель с экстрактом алоэ, хлоргексидином и DMSO; Б) Гель с экстрактом календулы, хлоргексидином и DMSO 8,90 ± 0,23* 11,00 ± 0,87** 20,80 ± 0,41*^ 23,80 ± 1,17*^ Примечание: * - Р < 0,01 по отношению к контролю; ** - P < 0,01 по отношению к гелю с экстрактом алоэ; ^ - P < 0,05 по отношению к Escherichia coli. Использование гелей БЦ показало, что гель, содержащий этиловый спирт не сдержи- вал рост E. coli, однако обладал выраженным антибактериальным действием по отноше- нию к Staphylococcus epidermidis. Добавление в гели экстракта, хлоргексидина и DMSO ха- рактеризовалось антибактериальным дей- ствием против E. coli, давая задержку роста около 11 мм. Но большую эффективность оказывали на рост Staphylococcus epidermidis. Наблюдаемый эффект был выше, чем у E. coli более, чем в 2 раза (табл. 1). Наблюдали значительную антибактери- альную активность «вторичных» плёнок БЦ с 2-амино-6-нитробензотиазолом, где площадь подавления роста Escherichia coli на третьи сутки культивирования составила 4,43 ± 0,67 см2. В то время как в контрольных чашках отметили практически сплошной газонный рост на самих образцах «вторичных» плёнок и вокруг них. Антифунгальные свойства «вторичных» плёнок БЦ с 2-амино-6-нитро- бензотиазолом выражены слабее, чем анти- бактериальные. Площадь подавления роста Aspergillus flavus на третьи сутки культи- вирования составила 2,37 ± 0,22 см2. В контрольных чашках наблюдали сплошной газонный рост Aspergillus flavus. Эффективным антибактериальным дей- ствием характеризовались «вторичные» гель- плёнки, приготовленные из геля с добавле- нием водных растворов поли-N,N-диметил- 3,4-метиленпирролидиний хлорида различ- ной концентрации (табл. 2). Снижение кон- центрации ПАДМАХа приводит к уменьше- нию антибактериального эффекта по отноше- нию к Escherichia coli (табл. 2). Разведение полимера в пять раз сопровождается сниже- нием диаметра ограничения роста на 27 % и площади отсутствия роста на 51 %. Полученные данные свидетельствуют о том, что использование первично гелей для фи- зической модификации бактериальной целлю- лозы и получение гелей «вторично» из гелей приводит к увеличению антибактериального эф- фекта используемых антибиотических соедине- ний. Полученные ранее данные о применении ПАДМАХа для пропитки сухих и влажных плё- нок БЦ показало, что эффективнее использова- ние влажных плёнок [6]. Ещё более эффектив- ным является использование изначально геля. Вероятно, перемешивание геля с антибиотиче- ским соединением происходит равномерно, со- единение полнее заполняет поры волокон цел- люлозы и антибиотический эффект увеличива- ется. Вестник молодых учёных и специалистов Самарского университета. 2018. № 2 (13) 39 Таблица 2 Зоны задержки роста E. сoli (2-е сутки культивирования) на плотной среде вокруг «вторичных» гель-плёнок БЦ с хлоридом полиаллилдиметиламмония различных концентраций Проба Диаметр зоны огра- ничения роста, мм Площадь отсутствия роста, % Контроль: «вторичная» гель-плёнка БЦ нет 0 «Вторичная» гель-плёнка БЦ + 15 % раствор ПАДМАХ 14,13 ± 0,23 9,87 ± 0,05 «Вторичная» гель-плёнка БЦ + 7,5 % раствор ПАДМАХ 12,56 ± 0,15* 7,80 ± 0,03* «Вторичная» гель-плёнка БЦ + 3,75 % раствор ПАДМАХ 10,75 ± 0,09*^ 5,71 ± 0,02*^ «Вторичная» гель-плёнка БЦ + 3% раствор ПАДМАХ 10,25 ± 0,09* 4,76 ± 0,02*^ Примечание: * - P < 0,01 по отношению к контролю; ^ - P < 0,01 по отношению к предыду- щему разведению ПАДМАХ. Заключение Гели бактериальной целлюлозы могут стать перспективным носителем антибиотиче- ских соединений. Гель легко перемешивается с этиловым спиртом, что приводит к его дезин- фекции по отношению к стафиллококкам. За- тем в гель можно добавить растворы или навески различных соединений, обусловлива- ющих антибактериальные, антифунгальные, иммуностимулирующие, регенерирующие и другие свойства. Гели можно будет применять как в нативном виде, так и в виде высушенных «вторичных» плёнок. Наилучший антибактери- альный эффект достигается при использовании композитов на основе «вторичных» гель-плё- нок, содержащих экстракт календулы или алоэ с добавлением хлоргексидина, причём он выше по отношению к грамположительным неспоро- образующим бактериям (Staphylococcus epidermidis), чем к грамотрицательным (Escherichia coli). Многие соединения, раство- римые в этиловом спирте можно добавлять в виде навески (2-амино-6-нитробензотиазол) и перемешивать гель с веществом в шейкере, что значительно увеличивает его биологический эффект. Для приготовления биологически ак- тивных композитов на основе гелей БЦ можно использовать водные растворы соединений (поли-N,N-диметил-3,4-метиленпирролидиний хлорид, DMSO) и спиртовые экстракты (экс- тракты календулы и алоэ). Благодарности Авторы выражают благодарность науч- ным руководителям: профессору Самарского университета Клёновой Наталье Анатоль- евне, доценту Самарского университета Бело- усовой Зое Петровне за всестороннюю по- мощь и поддержку, заведующему кафедрой бихимии, биотехнологии и и биоинженерии Самарского университета профессору Ревину Виктору Васильевичу и сотрудникам Мор- довского национального исследовательского университета имени Н. П. Огарёва за предо- ставление штамма Gluconacetobacter sucrofermentas H-110 и методическую кон- сультацию по культивированию ацетобакте- рий, а также сотрудникам кафедры биохимии, биотехнологии и биоинженерии Самарского университета за оказанную помощь при вы- полнении исследовательской работы.
×

Об авторах

Дарья Александровна Евдокименко

Самарский университет

Email: puhlenysh97@mail.ru
Самара, Россия

Ирина Сергеевна Мажанова

Самарский университет

Email: irinamazhanova@gmail.com
Самара, Россия

Валентина Сергеевна Соболева

Самарский университет

Email: soboleva.alechka15@mail.ru
Самара, Россия

Элина Юрьевна Сосова

Самарский университет

Email: ugrh12@mail.ru
Самара, Россия

Список литературы

  1. Nanocomposites of bacterial cellulose/hydroxyapatite for biomedical applications / Cr. J. Grande, F. G.Torres, C. M.Gomez, [et al.] // Acta Biomaterialia. 2009. Vol. 5. P. 1605-1615.
  2. Способ получения поли-N,N-диметил-3,4-диметилен-пирролидиний хлорида: пат. №2372333 / М. И. Черкашин, Е. Я. Борисова, Н. Ю. Борисова [и др.]. 10.11.2009. Бюл. 31.
  3. Способ борьбы с грибковыми и бактериальными заболеваниями cельскохозяйственных растений: пат. № 2371919 / В. Н. Абеленцев, М. Н. Черкашин, Е.Я. Борисова [и др.]. 10.11.2009. Бюл. 31.
  4. Ермохин В. А., Макарова М. В. Синтез замещённых N-(1-адамантанкарбоксамидо)- и N-(1-адамантилацетамидо)бензотиазолов // Бутлеровские сообщения. Казань. 2013. Т. 36. № 12. С. 92-96.
  5. Synthesis, spectral studies and biological evaluation of schiff base derivatives of benzothiazole for antimicrobial activity / К. Rajinder, K. Uday, K. Amandeep [et.al] // Research journal of pharmaceutical, biological and chemical sciences. 2012. Vol. 3. Iss. 4. P. 847-854.
  6. Получение и изучение свойств композитов на основе бактериальной целлюлозы и поли-N,N-диметил-3,4-метиленпирролидиний хлорида / В. В. Ревин, Н. А. Клёнова, Н. А. Редькин [и др.] // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2017, Т. 7. № 1. С.102-110.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Вестник молодых учёных и специалистов Самарского университета, 2018

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License.

Вестник молодых учёных и специалистов Самарского университета

Сетевое издание, журнал

ISSN 2782-2982 (Online)

Учредитель и издатель сетевого издания, журнала: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Самарский национальный исследовательский университет имени академика С.П. Королева» (Самарский университет), Московское шоссе, 34, 443086,  Самарская область, г. Самара, Российская Федерация.

Сетевое издание зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, регистрационный номер ЭЛ № ФС 77-86495 от 29.12.2023

Выписка из реестра зарегистрированных СМИ

Устав сетевого издания

Главный редактор: Андрей Брониславович Прокофьев, доктор технических наук, доцент, заведующий кафедрой теории двигателей летательных аппаратов

2 выпуска в год

0+. Цена свободная. 

Адрес редакции: 443011, Самарская область, г. Самара, ул. Академика Павлова, д. 1, Совет молодых учёных и специалистов, каб. 513 корпуса 22 а.

Адрес для корреспонденции: 443086, Самарская область, г. Самара, Московское шоссе, 34, Самарский национальный исследовательский университет (Самарский университет), 22а корпус, каб. 513.

Тел: (846) 334-54-43

e-mail: smuissu@ssau.ru

Доменное имя: VMUIS.RU (справка о принадлежности домена)электронный адрес в сети Интернет:  https://vmuis.ru/smus.

Прежнее свидетельство – периодическое печатное издание, журнал «Вестник молодых учёных и специалистов Самарского университета», зарегистрировано Управлением Федеральной службы по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций по Самарской области, регистрационный номер серии ПИ № ТУ63-00921 от 27 декабря 2017 г.

© Самарский университет

 

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах