CORRELATION STUDIES OF THE FLUORESCENCE OF THE SCLERA AND SKIN OF THE HUMAN

Full Text

Введение

Благодаря процессу флуоресценции появилась возможность достаточно точно проводить обследования различных областей человеческого организма неинвазивными методами. Одним из биологических флюорофоров являются конечные продукты гликирования (КПГ). КПГ образуются в живом организме в результате реакции Майяра между аминокислотами и сахарами. В нормальных условиях скорость реакции мала, и КПГ успевают удаляться из организма. Однако при повышении сахара в крови при диабете или при нарушении экскреторной способности почек реакция значительно ускоряется, что приводит к более интенсивному накоплению КПГ [1]. Было установлено, что КПГ приводят к повреждению сердца и сосудов, поэтому необходимо проводить оценку их содержания в биотканях.

Ранее оценка содержания КПГ в тканях проводилась только с помощью биопсии кожи. Этот способ инвазивен и требует больших затрат времени и средств, что не позволяет проводить широкомасштабные исследования. В настоящее время есть новый метод, позволяющий проводить измерения быстро и неинвазивно, основанный на явлении автофлуоресценции биологических тканей. Впервые на связь автофлуоресценции и содержания КПГ обратили внимание офтальмологи, обнаружившие повышенную автофлуоресценцию у больных сахарным диабетом, что обусловлено накоплением КПГ в хрусталике. В дальнейшем выяснилось, что КПГ накапливаются и в коже, по которой намного удобнее проводить измерения. Однако данные измерения флуоресценции ограничены фототипом кожи [2].

Экспериментально было получено, что у здоровых людей автофлуоресценция увеличивается с возрастом в среднем на 1,1–1,2% в год [1], однако при терминальной почечной недостаточности (ТПН) корреляция с возрастом пропадает. Также при ТПН наблюдается сильное увеличение автофлуоресценции по сравнению с нормальной автофлуоресценцией. У реципиентов почечного трансплантата (РПТ) наблюдается корреляция автофлуоресценции с возрастом, но ниже нормы, а также увеличение автофлуоресценции, меньшее, чем при ТПН, но не достигающее нормы. Кроме того, была подтверждена гипотеза о том, что накопление КПГ может быть предиктором хронической дисфункции почечного трансплантата.

Объекты и методы

Склеральная ткань глаза человека содержит примерно 50% коллагена по весу, поэтому есть основания предположить, что КПГ в склере также могут служить биомаркерами упомянутых выше заболеваний. Склера столь же доступна для флуоресцентной диагностики in vivo, что и кожа, и не отмечается существенных расовых различий в строении тканей глаза. Причем, если использовать стандартный прибор офтальмолога – щелевую лампу, то диагностика по глазу может производиться бесконтактно.

Для проведения экспериментов используются портативный диагностический лазерный флуориметр, разработанный для медицинской диагностики по поверхности кожи предплечья человека, и модернизированная офтальмологическая щелевая лампа ЩЛ-2Б.

Щелевая лампа ЩЛ-2Б представляет собой совокупность интенсивного источника света – осветителя и бинокулярного стереоскопического микроскопа с внутренним устройством для плавной смены увеличений. В основу работы лампы положено получение светового пучка определенной формы, направляемого на исследуемый участок глаза, и наблюдение этого участка с помощью микроскопа. Форма светового пучка задается диафрагмой (щелью), входящей в оптическую схему осветителя. Изображение щелевой диафрагмы получается в виде ярко освещенной световой плоскости, которая может быть направлена на любую часть глаза. Для возбуждения флуоресценции на штатный осветитель был установлен лазерный модуль SLD3134VF с длиной волны излучения 405 нм. Данная длина волны находится в диапазоне спектра, в котором внутриглазная жидкость практически прозрачна и не препятствует получению диагностической информации [3]. Полученные изображения лазерного излучения и в белом свете регистрировались камерой ТоuрСаm ЅСМОЅ00350КРА. При обследовании лазерный диод и лампа настраивались на совмещение освещаемых ими участков глаза или кожи. Излучение лазерного модуля SLD3134VF в приёмном канале отфильтровывалось полиимидной плёнкой толщиной 40 мкм, отрезающей фиолетовое излучение. Плёнка установлена перед входным окном бинокулярного микроскопа щелевой лампы [4]. Принципиальная схема установки представлена на рисунке 1, а внешний вид на рисунке 2.

Рис. 1. Принципиальная схема модернизированной щелевой лампы ЩЛ-2Б: 1 – лазерный модуль SLD3134VF, 2 – осветитель, 3 – блок управления источниками излучения, 4 – камера ToupCam SCMOS00350KP, 5 – полиимидная плёнка, 6 – бинокулярный микроскоп

а)                                                                               б)

Рисунок 2 – Модернизированная щелевая лампа: 1 – персональный компьютер (ПК), 2 – осветитель, 3 – камера ToupCam SCMOS00350KPA, 4 – полиимидная плёнка, 5 – источник питания лазера Б5-44А, 6 – источник питания осветителя, 7 – бинокулярный микроскоп, 8 – лазерный модуль SLD3134VF; а) со стороны пациента, б) со стороны врача

Оптическая схема диагностического флуориметра с лазерным возбуждением и микроконтроллерным управлением приведена на рисунке 3. Возбуждение автофлуоресценции (АФ) КПГ осуществляется излучением фиолетового лазерного диода SLD3134VF с пиковой длиной волны 405 нм 1, которое проходит через коллимирующую линзу 2 и защитное стекло 3 (предметное стекло микроскопа толщиной 1 мм). К защитному стеклу с внешней стороны прикладывается внутренняя сторона предплечья – флуоресцирующий объект исследования 4. Часть рассеянного кожей предплечья возбуждающего и флуоресцентного излучений 10 через отрезающий интерференционный фильтр LP435 5 падает на фотодиод 6. Другая часть рассеянного излучения падает на фотодиод 11, который является частью канала упругого рассеяния. Все элементы оптической схемы размещены внутри светонепроницаемого металлического кожуха 8. Внутри кожуха также размещена плата электроники 7, управляемая платой Arduino Nano 13, которая обменивается данными с персональным компьютером 12.

Рис. 3. Оптическая схема диагностического флуориметра с лазерным возбуждением и микроконтроллерным управлением: 1 – лазерный диод Sony SLD3134VF, 2 – коллиматор, 3 – защитное стекло, 4 – объект исследования, 5 – отрезающий интерференционный фильтр LP435, 6, 11 – фотодиоды ФД24К, 7 – плата электроники, 8 – металлический кожух, 9 – поток энергии возбуждения, 10 – рассеянный в сторону фотоприёмников поток излучения, 12 – персональный компьютер, 13 – плата Arduino Nano

Используемая плата Arduino Nano легко программируется в общедоступной среде разработки Arduino IDE. Написанную для разработанного флуориметра программу можно разделить на три части: подготовительная часть; сбор информации о пациенте; проведение измерений. Программа начинает своё выполнение после проверки кода, его компиляции и загрузки на плату.

В подготовительной части один из цифровых контактов платы Arduino Nano, к которому подключен лазер, объявляется выходным с использованием функции pinMode(lasPin, OUTPUT) [5]. После этого открывается обмен данными между компьютером и платой со скоростью 9600 бод (бит/с), что осуществляется функцией Serial.begin(9600). Затем с использованием функции tone(lasPin, 1000) на лазер подаются прямоугольные импульсы с частотой следования 1000 Гц [6].

Далее начинается сбор информации о пациенте, которую вводит оператор в мониторе порта Arduino IDE. Среди собираемой информации: ФИО, пол, возраст, стаж курения и диагноз пациента. С использованием функции Serial.print() в монитор порта выводится сообщение о необходимости ввода той или иной информации об объекте исследований [7], после чего оператор вводит запрашиваемые данные и отправляет их на плату Arduino. Текстовые данные считываются функцией Serial.readString(), а числовые – функцией Serial.parseInt(). После получения платой данные выводятся в монитор порта для проверки их корректности.

После сбора информации о пациенте предлагается ввести желаемое количество измерений, которое также выводится в монитор порта. Пациент кладет руку на флуориметр внутренней стороной предплечья, так как данная область менее подвержена инсоляции и практически не обладает волосяным покровом, а затем начинается проведение измерений.

Получение данных с фотодиодов и их вывод в монитор порта осуществляется в цикле while (i < num) [5], где i – некоторая переменная, изначально равная нулю и увеличиваемая на единицу при каждом прохождении цикла; num – введенное оператором количество измерений. Прием данных с фотодиодов осуществлен с использованием функции analogRead(), где в скобках указан аналоговый вход платы Arduino Nano, к которому подключен фотодиод – A0 для регистрации упруго рассеянного излучения, A1 для регистрации флуоресценции. Вывод полученных данных также производится с помощью функции Serial.print(). Функцией delay() в конце цикла задается задержка (в мс) перед получением и выводом новых данных.

По окончанию проведения измерений программа информирует об этом выводом сообщения «Конец измерений». После этого оператору требуется скопировать все полученные данные из монитора порта и перенести их в текстовый документ. Последующая обработка данных осуществляется оператором вручную в программе Microsoft Excel.

По результатам, полученным после проведения измерений, для каждого эксперимента рассчитывались средние арифметические (СА) значения интенсивностей упруго рассеянного и флуоресцентного излучений. По ним рассчитывался диагностический параметр испытуемого, полученный на флуориметре (ДПФ), – отношение СА значения интенсивности флуоресценции к СА значению интенсивности рассеянного излучения. Расчет диагностического параметра требуется для частичного устранения индивидуальных различий оптических свойств кожи, в частности, её фототипа.

Щелевая лампа также позволяет провести флуоресцентную диагностику с поверхности кожи. Для этого пациент кладет руку так, чтобы освещалась его внутренняя сторона предплечья (рис. 4, а, б, в).

а)                    б)                                   в)                                          г)

Рис. 4. Области исследования: а) подготовка к эксперименту с рукой, б) исследование руки в свете лампы, в) исследование руки в свете лазера; г) исследование склеры глаза

При исследовании склеры глаза пациент должен смотреть в сторону, широко открыв глаза. Излучение осветителя или лазера направляется в указанную область склеры (рис 4, г).

В отличие от флуориметра, на щелевой лампе первичным экспериментальным материалом являлись два цветных кадра изображения, один из которых был получен при освещении лазером, а другой при освещении белым светом (рис. 5). Полученные изображения в дальнейшем обрабатывались с помощью разработанной в Mathcad программы обработки цветовых компонент, а именно R, G, B. Ведущей компонентой была зеленая (G) компонента флуоресцентного изображения, потому что в её происхождении преобладает флуоресценция [8]. Так как флуоресцирующая область занимала малую долю кадра (рис. 5, б), то первой процедурой обработки являлось выделение информационного фрагмента. Для исключения шумовых пикселей проводилась пороговая обработка фрагмента с порогом, привязанным к максимальному значению пикселя. Помимо этого, происходило усреднение, так как информационная область меняла свою площадь и форму от эксперимента к эксперименту. Для этого рассчитывалось количество ненулевых элементов субматрицы. В конечном итоге программа позволяла получить значения отношения среднеарифметического значения G-компоненты изображения, полученного при освещении исследуемого участка лазерным диодом, к среднеарифметическому значению G-компоненты изображения при белом свете. В дальнейшем данное отношение будем называть диагностическим параметром испытуемого, полученного на щелевой лампе (ДПЩЛ).

 
         а)                                                         б)

Рис. 5. Зарегистрированные изображения склеры глаза: а) в белом свете, б) в излучении лазера

Результаты и их обсуждение

Эксперименты проводились в течении трех месяцев на восьми здоровых людях: 1 женщине и 7 мужчинах, относящихся к разным возрастным группам от 16 до 70 лет. Всего было проведено 66 измерений на обоих приборах. Испытуемые были разделены на три возрастные группы: 16-25 лет, 26-35 лет и 66-75 лет. В первую возрастную группу входило 4 человека, во вторую – 3 человека. К третьей возрастной группе относился 1 человек. Результаты экспериментов представляют собой, как уже было сказано выше, диагностические параметры. В качестве погрешностей на графики нанесены коэффициенты вариации (КВ), которые равны отношению среднеквадратичного отклонения диагностических параметров внутри исследуемой возрастной группы к среднему арифметическому значению диагностического параметра.

На рисунке 6 приведен график зависимости ДПФ от усредненного возраста исследуемых возрастных групп. По графику видно возрастание диагностического параметра с возрастом, что было отмечено ранее в других исследованиях [9].

Рис. 6. Значения диагностических параметров, полученных на флуориметре, для трех возрастных групп

Зависимость ДПЩЛ, полученного с руки, от усредненного возраста представлен на рисунке 7. На графике также виден рост диагностического параметра с возрастом. Кроме того, значения ДПЩЛ руки соизмеримы со значениями ДПФ.

Рис. 7. Значения диагностических параметров с руки, полученных на щелевой лампе, для трех возрастных групп

Значения диагностического параметра со склеры приведены на рисунке 8. Вид кривой аналогичен предыдущим приведенным кривым для руки.

Рис. 8. Значения диагностических параметров со склеры, полученных на щелевой лампе, для трех возрастных групп

Из рисунков 6 - 8 видно, что диагностические параметры, полученные со склеры, имеют большие значения, чем полученные с руки. Это подтверждает ранее сказанные о склере глаза теоретические данные. Таким образом, склера позволяет расширить область флуоресцентной диагностики и преодолеть различия фототипов кожи.

Сравним рассчитанные для каждой возрастной группы коэффициенты вариации, обусловленные индивидуальными различиями. Их значения приведены в таблице 1.

Таблица 1

Коэффициенты вариации диагностических параметров

Видно, что для руки на щелевой лампе коэффициент вариации в группе 26-35 лет имеет большое значение. На его величину повлияло множество факторов: различия фототипов кожи испытуемых, малое количество проведенных измерений, невозможность точного воспроизведения нужного положения руки. Последний фактор обуславливает и различия между коэффициентами вариации для руки, полученными с флуориметра и с щелевой лампы, так как на флуориметре невоспроизводимость положения руки вероятна только в одной плоскости, что оказывает меньшее влияние на получаемые данные.

Коэффициенты вариации диагностических параметров, полученных со склеры, для всех исследуемых возрастных групп в среднем меньше, чем коэффициенты вариации, полученные с руки. Это позволяет говорить о большей предпочтительности использования склеры для флуоресцентной диагностики.

Для нахождения статистической связи между диагностическими параметрами, полученными с руки и со склеры, был проведен корреляционный анализ. Степень связи между двумя независимыми переменными показывает коэффициент корреляции Пирсона, который рассчитывается по формуле:

где X и Y – независимые случайные величины, а их средние значения:

Если коэффициент корреляции близок к 1, то между переменными наблюдается положительная корреляция. Иными словами, отмечается высокая степень связи между переменными. Если коэффициент корреляции близок к -1, это означает, что между переменными имеет место сильная отрицательная корреляция. Иными словами, поведение второй переменной будет противоположным поведению первой. Промежуточные значения, близкие к 0, будут указывать на слабую корреляцию между переменными и, соответственно, низкую зависимость. Иными словами, поведение переменной X не будет совсем (или почти совсем) влиять на поведение Y (и наоборот) [10].

Были рассчитаны коэффициенты корреляции Пирсона между диагностическими параметрами. Между значениями ДПФ и ДПЩЛ с руки коэффициент Пирсона составил 0,91; между значениями ДПФ и ДПЩЛ со склеры – 0,93; между значениями ДПЩЛ с руки и ДПЩЛ со склеры – 0,90. Полученные значения указывают на высокую степень связи между диагностическими параметрами.

Выводы

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было получено, что склера обладает большими значениями диагностических параметров, чем рука. Это обусловлено различиями состава склеральной ткани глаза и кожи. В склере не содержится меланин, который интенсивно поглощает излучение ультрафиолетового и фиолетового оптических диапазонов. Кроме того, поверхность склеры увлажнена и не обладает макрорельефом [11].

Коэффициенты вариации, полученные для склеры, позволяют сделать выводы о том, что склеральная ткань глаза является более предпочтительной для проведения флуоресцентной диагностики КПГ. Однако в том случае, когда важными являются скорость и удобство проведения измерений, то диагностику лучше проводить по коже с использованием портативного флуориметра.

Проведенный корреляционный анализ показал, что диагностические параметры, полученные для руки и для склеры, обладают высокой статистической связью. Это доказывает, что полученные параметры тесно связаны между собой, и флуоресцентную диагностику можно проводить как по коже, так и по склере, так как диагностические параметры показывают одно и то же.

About the authors

Alsu I. Sharafutdinova

Author for correspondence.
Email: alsu.irikovna.63@gmail.com
Russian Federation

Maxim A. Syavas

Email: sven910@mail.ru

Supplementary files