ASSESSMENT OF VULPINIC ACIDS CYTOTOXICITY

Abstract

The article says results of evaluation of the cytotoxicity effect of the secondary metabolite lichen Vulpicida pinastri vulpinic acid using Аllium-test. Shows the ability vulpinic acid in concentrations 0,0275; 0055; 0,11 mg/ml to inhibit pullulation seeds, proliferative activity in cells of the root meristem, represented by a mitotic index decrease. Blocking of mitosis at impact high concentration of vulpinic ac- id at the stage of prophase, in much lower concentrations at the stages of anaphase and telophase.

Full Text

Экологический успех симбиозов, соз- дающих лишайники, может, хотя бы отчасти, объясняться образованием органических со- единений - вторичных метаболитов. Вторич- ные метаболиты лишайников формируются грибами, а их присутствие ограничено собст- венно лишайниками. Они отлагаются в виде кристаллов на поверхности гиф, на лишайни- ковых водорослях, и обычно составляют от 0,1 до 5 % от сухого веса таллома. Более 1000 вто- ричных метаболитов обнаружено в составе лишайников, но только для 7 % из них также показано присутствие в нелихенизированных грибах и даже в высших растениях [1-3]. Они слабо растворимы в воде и обычно извлекают- ся из талломов органическими растворителями [3]. Свыше тысячи вторичных метаболитов, главным образом моноароматические соедине- ния, депсиды, депсидоны, пульвинаты, дибен- зофураны, антрахиноны и ксантоны, выделены из лишайников [4]. Лишайниковые вещества обладают широким спектром направлений биологической активности, включая антибио- тическое, противогрибное, противовирусное, противовоспалительное, обезболивающее, жа- ропонижающее, противоопухолевое и цито- токсическое действия [5, 6]. Лишайник Вульпицида сосновая является довольно распространенным видом в лесах Са- марской области [7]. Из анализа литературных данных известно, что основным токсическим © Горина М. В., 2015. Горина Мария Владимировна (gorina.mariya2011@yandex.ru), аспирант биологического факультета Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Академика Павлова, 1. компонентом лишайника, вызывающим смерть позвоночных, в частности млекопитающих, яв- ляется вульпиновая кислота, способная, кроме того, ингибировать рост РНК и ДНК- содержащих вирусов, а также рост раковых опу- холей [8]. Поскольку основным свойством виру- сов является способность к делению, возможно, вульпиновая кислота способна влиять на мета- болизм ДНК не только вирусов, но и эукариот. В данной работе представлены результаты оценки цитотоксичности экстрагиро- ванной из талломов лишайника Vulpicida pi- nastri (Scop.) J.-E. Mattson et M. J. Lai. вульпиновой кислоты с использованием Al- lium-теста, рекомендованного в качестве тест-систем для оценки генотоксичности природных и техногенных агентов [9, 10]. Условия и методы исследования Пробы талломов лишайника Vulpicida pinastri были отобраны территории Красноса- марского лесного массива летом 2012 и 2013 гг. со стволов деревьев Betula pendula Roth. и Pinus sylvestris L. в количестве до 10 грамм. Подробная биоэкологическая характе- ристика данных образцов приводится в нашей предыдущей работе [11]. Собранные образцы очищались от субстрата, восходящие лопасти таллома отделяли и высушивали несколько дней до воздушно-сухого состояния, затем экс- трагировали ацетоном (1 г лишайника на 50 мл растворителя) в течение 30 дней. Вытяжку на- носили на силикагелевые пластины «Sorbfil» на алюминиевой подложке в виде штриха в количестве 0,1 мл для восходящей хромато- граммы в системе растворителей н-бутанол- аммиак (25 %) в соотношении 4:1. На хроматограммах производили иден- тификацию лишайниковых веществ по цвету пятна и по величине Rf. Участки хромато- граммы с Rf = 0,92 (пятна желтого цвета) вы- резали и элюировали 3 мл ацетона [12]. Полу- ченные растворы выпаривали до образования кристаллов чистой вульпиновой кислоты, ко- торые использовали для приготовления рас- творов и оценки их гено- и цитотоксичности по стандартной методике Allium-теста [13]. В качестве тест-объекта использовали семена лука Allium cepa L. сорта «Ред-барон», ко- торые высевали в количестве 30 штук на чашку Петри и проращивали на фильтровальной бу- маге, смоченной тестируемыми растворами вульпиновой кислоты в трех концентрациях: 0,0275; 0,055; 0,11 мг/мл. Растворителем слу- жил 5 %-ный водный раствор изопропанола. Оценка цитотоксического эффекта проводилась для гидрофобного раствора вуль- пиновой кислоты с расчетом митотического индекса и проведением ана-телофазного ана- лиза. При анализе анафаз учитывались толь- ко те клетки, в которых расстояние между хромосомными группами больше ширины одной ана-телофазной группы. Не проводили анализ ана-телофаз с наложением клеток и при нарушении целостности оболочек. Для каждого варианта опыта исследовали не ме- нее 1000 клеток, не менее 300 ана-телофаз, для расчета митотического индекса в сумме было проанализировано не менее 7000 кле- ток, 2100 ана-телофаз. Микроскопирование препаратов вы- полняли на микроскопе ЛOMO «Микмед-1» при 600-кратном увеличении. Достоверность отличий между действиями различной кон- центрации вульпиновой кислоты на величи- ну митотического индекса и относительную длину фаз митоза оценивали с помощью полного двухфакторного дисперсионного анализа. Результаты и их обсуждение При оценке генотоксичности вульпи- новой кислоты с помощью Allium-теста одним из первых этапов работы был анализ способности растворов вульпиновой кислоты влиять на всхожесть семя лука (рис. 1). Оказалось, что в избранном диапазоне концентрации вульпиновая кислота слабо влияет на всхожесть. Проведенный однофак- торный дисперсионный анализ выявил дос- товерные отличия между опытом и контро- лем, но необходимо отметить, что наиболее низкая концентрация вульпиновой кислоты проявляла ингибирующие свойства по срав- нению с более высокими концентрациями, что, возможно, связано с затрудненным про- хождением данного соединения в высоких концентрациях через семенную кожуру. Проанализируем способность вульпиновой кислоты влиять на пролиферативную активность корневой меристемы Allium cepa (рис. 2). Оказалось, что в низких концентра- циях вульпиновая кислота ингибирует кле- точное деление. Наблюдаемое стимулирова- ние высокими концентрациями растворов можно понять при анализе продолжительно- сти фаз митоза в опыте и контроле (рис. 3). Рис. 1. Влияние разной концентрации вульпиновой кислоты на всхожесть семян Allium cepa Рис. 2. Влияние разной концентрации вульпиновой кислоты на пролиферативную активность клеток корневой меристемы Allium cepa Рис. 3. Влияние разной концентрации вульпиновой кислоты на относительную продолжительность фаз митоза клеток корневой меристемы Allium cepa Анализируя приведенные выше результа- ты, можно заключить, что увеличение митоти- ческого индекса после воздействия вульпино- вой кислоты в самой высокой концентрации связано с торможением клеточного деления на стадии профазы, что свидетельствует о высокой токсичности этого соединения и его способно- сти вмешиваться в метаболизм предшественников синтеза ДНК. Из рис. 3 видно, что наблюда- ется торможение деления во время стадии ана- фазы при концентрации 0,0275 мг/мл и на ста- дии телофазы при концентрации 0,055 мг/мл соответственно. Такого рода ингибирование обычно ведет к появлению самых различных патологий митоза. Мы их наблюдали при ана- лизе цитогенетических препаратов (рис. 4). а б в г д е ж з и к Рис. 4. Различные виды хромосомных аберраций в клетках меристемы корня Allium cepa при воздействии вульпиновой кислоты (ориг. х 400, 2014г.): а - потеря хромосом, хроматидный мост, б - дефрагментация хромосомного моста, в - фрагментированные хромосомные хвосты, г - двойная зеркальная потеря хромосом, д - дефрагментированная потеря хромосом, е - разрушение нитей веретена деления хромосом, ж - хромосомный хвост, з - множественное нерасхождение хромосом, и - нерас- хождение, потеря и задержка хромосом, к - потеря хромосомы и хромосомный хвост. Результаты проведенных исследований показали, что при любой исследуемой нами концентрации вульпиновой кислоты возни- кают все известные типы хромосомных па- тологий, за исключением многополюсных митозов, что свидетельствует о влиянии вульпиновой кислоты на репликацию ДНК и ее рекомбинацию, вследствие чего появля- ются инверсии, транслокации, выражающие- ся в наблюдаемых цитогенетических повре- ждениях. Количественный ана-телофазный анализ показал, что число хромосомных па- тологий растет с увеличением концентрации вульпиновой кислоты (р < 0,05). Заключение Таким образом, вульпиновая кислота способна влиять на прорастание семян, ин- гибируя или ставя их в зависимость от кон- центрации, а также ингибировать пролифе- ративную активность в клетках корневой ме- ристемы, что выражается в снижении ее ми- тотического индекса, блокируя митотиче- ские деления в высокой концентрации на стадии профазы, а в более низкой - на ста- дии анафазы и телофазы. Вульпиновая кислота индуцирует хромосомные аберрации, и с ростом ее концентрации возрастает и мутагенная активность. Можно также отметить, что цитотоксичность и мута- генная активность определяется скоростью ее проникновения через мембраны живых клеток и ее высокой липофильностью. Присутствие фу- ранозного кольца в данной молекуле может, на наш взгляд, обеспечивать два пути поступления кислоты внутрь клетки: растворение в мембра- нах и пиноцитоз. Наличие гидроксильных групп и двойных связей у кислорода позволяют ду- мать, что данное соединение может выступать как фактор сенсибилизации действия гамма- излучения, именно поэтому в экспериментах с оценкой действия вульпиновой кислоты на ме- ланомы ее цитотоксичность резко возрастала даже при малой интенсивности гамма- излучения. Возможно, именно цитотоксичность вульпиновой кислоты приводит к подавлению роста миксомицетов и ингибированию ДНК- содержащих вирусов. Проведенные нами ис- следования показали и мутагенность, и цито- токсичность вульпиновой кислоты. Ее дериваты не только мутагенны и цитотоксичны, но и мо- гут проявлять антиоксидантную активность.