THE INFLUENCE OF THE TYPE OF COMMUNITIES AND THE POSITION IN THE RELIEF ON THE ACCUMULATION OF LICHEN SUBSTANCES

Full Text

Для фитоиндикации биотопа можно использовать разные биологические объекты: цветковые растения, мохообразные или лишайники. Лишайники же, обитая в наземно-воздушной среде, позволяют охарактеризовать экологические условия, например, аэротопа; в отличие от сосудистых растений, которые, как правило, показывают влажность почвы. Однако, чтобы проводить фитоиндикацию биотопа с помощью лишайников, нужно для начала изучить обратный процесс влияния экологических факторов на накопление в них химических веществ.

Органические вещества, которые встречаются в лишайниках, по своей природе разделяются на две основные группы: первичные и вторичные метаболиты. Первичные метаболиты – это белки, аминокислоты, полисахариды, витамины и прочие органические соединения, которые синтезируются фотобионтом или микобионтом и находятся внутри их клеток – часто они растворимы в воде.

Вторичные лишайниковые вещества синтезируются микобионтом, хотя углерод, необходимый для их синтеза, грибной компонент лишайника получает от синтезирующего органические соединения фотобионта. Вторичные метаболиты находятся в талломе лишайника экстрацеллюлярно и обычно они нерастворимы в воде. Вторичные метаболиты лишайников длительное время называли лишайниковыми кислотами. Однако оказалось, что к вторичным метаболитам лишайников относятся соединения различной природы, а именно: ряд производных аминокислот, сахароспирты, алифатические кислоты, γ-, δ- и макроциклические лактоны, моноциклические ароматические вещества, хиноны, хромоны, ксантоны, дибензофураны, депсиды, депсидоны, депсоны, терпеноиды, стероиды и каротиноиды. Набор лишайниковых веществ видоспецифичен [1].

Кроме того, сами процессы накопления веществ в лишайниках довольно слабо изучены. Так, например, было отмечено, что повышение количества аллопротолихестериновой и протолихестериновой кислот в талломе Flavocetraria cucullata происходит в период с марта по июль – это увеличение концентрации веществ, связывают именно с активацией метаболического процесса в данное время [2]. Конечно, здесь следует учитывать, что в талломах лишайников содержание воды колеблется в самых широких пределах, в связи с чем довольно сложно проводить исследования по изучению химического состава данных организмов. Тем не менее есть указания в литературе, что наибольшее содержание вторичных лишайниковых метаболитов наблюдается в местах с частым выпадением осадков, например, в условиях лесного пояса. Было выявлено также, что вторичные лишайниковые вещества не накапливаются с возрастом лишайника, что они являются соединениями, которые активно используются в их обмене веществ [3].

Значение лишайниковых веществ для функционирования самих лишайников не до конца изучено. К основным функциям вторичных метаболитов лишайников сегодня можно отнести защиту от ультрафиолетового излучения и от поедания насекомыми и другими животными, влияние на проводимость клеточной стенки фотобионта, стимулирование транспорта углеводов из микобионта в фотобионт, антибиотические свойства [1].

Лишайникобразующие грибы способны синтезировать биологически активные вещества, например, с антибактериальной активностью, противовирусной, антибиотической и другими формами активности, которые находят своё применение в фармакологии и медицине [4].

 

Условия и методы исследования

В качестве района исследования нами был избран Красносамарский лесной массив, который является уникальным и единственным достаточно крупным лесным массивом для степных зон Самарской области, а также всей территории юго-восточной европейской России [5].

Нами были выбраны четыре основные лесные формации: сосняк, березняк, осинник и дубрава. Для сравнения вторичных метаболитов эти сообщества были рассмотрены с двух позиций – на арене и в пойме (рис. 1, 2).

Рис. 1. – Район исследования: звёздочкой (*) отмечены исследуемые пробные площади на арене (18, 38 – дубравы, 21, 39 – осинники, 22, 40 – березняки, 23Б, 23В – сосняки)

 

Рис. 2. – Район исследования: звёздочкой (*) отмечены исследуемые пробные площади в пойме (33, 35 – дубравы, 8В, 16ГП – осинники, 8Б, 8А – березняки, 13, 13Б – сосняки)

 

Таким образом, в сосняках нами были собраны такие виды как Cladonia fimbriata, Evernia mesomorpha, Hypogymnia physodes, Parmelia sulcata; в березняках – Cladonia fimbriata, Hypogymnia physodes, Parmelia sulcata, Physconia enteroxantha; в осинниках – Xanthoria parietina, Parmelia sulcata, Physconia enteroxantha; в дубравах – Cladonia fimbriata, Evernia prunastri, Hypogymnia physodes, Parmelia sulcata, Physconia enteroxantha.

Собранные образцы были очищены, взвешены в количестве от 0,003 до 0,006 г на весах CBL 220Н и залиты в 5 мл хлороформом на 3 дня. Мы выбрали в качестве элюента хлороформ, так как он является полярным растворителем, в котором лучше растворяется большинство, изучаемых нами вторичных метаболитов лишайников.

После нам необходимо было получить чистые вещества, для чего мы использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) [6].

На алюминиевых пластинах с силикагелем снизу прочерчивают мягким карандашом 10 точек на расстоянии 10 см друг от друга. Затем на каждую точку наносят 5 раз капилляром ацетоновый экстракт лишайника с использованием прибора УПС–1 при температуре 70–80^оС. После пластины помещают на 10 минут в пары ледяной уксусной кислоты, а потом в хроматографическую камеру с сольвентом С (толуол и уксусная кислота в соотношении 17:3 мл соответственно). Через 40–50 минут, когда растворитель дойдёт почти до конца пластины, отмечают простым карандашом эту линию, достают и сушат около 30 минут. Затем пластины помещают в УФС 254/365 и просматривают в УФ-лучах, при l= 254 нм и 380 нм. При этом карандашом обводят светящиеся пятна на всех 6 пластинах из них 3 пластины смачивают  10-% H₂SO₄ и сразу же нагревают в термостате ШС–80–01 СПУ при температуре 110^оС до проявления оранжевой норстиктовой кислоты в контроле.

Определяют вещества по определителю Orange А., James P. W., White F. J. Microchemical methods for the identification lichens [6] и идентифицируют светящиеся пятна в УФ-лучах на бесцветных пластинах. В последующем на них скальпелем снимают силикагель с чистым веществом в пробирку Эппендорфа и сразу добавляют 4–5 капель чистого ацетона (элюируют). По прошествии двух дней капилляром берут каплю вещества из пробирки и перемещают на предметное стекло. После высыхания ацетона предметное стекло просматривают в микроскопе Микмед-6 на наличие кристаллов кислот и фотографируют при помощи камеры Levenhuk C1400 NG и программы ToupView 3.7.27.74. Это является таким методом определения вторичных метаболитов лишайников как микрокристаллизация.

Зная форму и размеры конкретных веществ, мы приступили к количественной оценке лишайниковых веществ в ацетоновых вытяжках. Для чего мы брали каплю получившегося экстракта из лишайника, капали на предметное стекло и просматривали на микроскопе под увеличением ´40, кроме секалоновой кислоты А – её рассматривали под увеличением ´90. Четыре поля зрения каждой капли фотографировали, чтобы оценить количественное и качественное содержание вторичных метаболитов лишайников методом микрокристаллизации по пятибалльной шкале.

Также мы использовали другой подход – спектрофотометрия (на спектрофотометре
ПЭ-5400УФ), чтобы оценить количественное содержание вторичных метаболитов лишайников. Для этого исходную вытяжку лишайника с хлороформом мы колориметрировали при l = 190 – 600 нм с шагом сканирования 1 нм и при оптической длине кюветы 10 мм.

Двухфакторный дисперсионный анализ без повторений был осуществлён с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel 2016.

 

Результаты и их обсуждения

В исследуемых лишайниках после ТСХ и метода микрокристаллизации нами было обнаружено 9 видов лишайниковых веществ. К ним относятся следующие вторичные метаболиты: у Cladonia fimbriata – фумарпротоцетраровая кислота, у Evernia mesomorpha – диварикатовая кислота, у Evernia prunastri – атранорин, усниновая и эверновая кислоты, у Hypogymnia physodes – атранорин и физодаловая кислота, у Parmelia sulcata – атранорин и салациновая кислота, у Physconia enteroxantha – секалоновая кислота А, у Xanthoria parietina – париетин. Отметим, что ряд соединений, указанных в литературе, не было обнаружено в изученных образцах.

После ТСХ и микрокристаллизации были получены фотографии следующих чистых веществ: атранорин, диварикатовая кислота, париетин, салациновая кислота, секалоновая кислота А, усниновая, физодаловая, фумарпротоцетраровая и эверновая кислоты. Ранее нами были опубликованы фотографии кристаллов атранорина, диварикатовой кислоты, париетина, салациновой, физодаловой, фумарпротоцетраровой кислот [7], а на рисунке 3 представлены фотографии трёх новых кислот, которые мы получили в этом году.

Оказалось, что разные вторичные метаболиты кристаллизуются в разных частях капли экстракта при высыхании растворителя (ацетона) на предметном стекле. Так, у самого края капли следует искать кристаллы атранорина, секалоновой кислоты А и эверновой кислоты; на периферии капли, но не у самого края – салациновой кислоты и париетина; в центре капли обычно образуются кристаллы диварикатовой, усниновой, фумарпротоцетраровой и физодаловой кислот.

 

Рис. 3. – Кристаллы вторичных метаболитов лишайников,
полученные из ацетоновых экстрактов: А – усниновая кислота;
Б – эверновая кислота; В – секалоновая кислота А

 

Результаты по количественному определению лишайниковых веществ методом микрокристаллизации и методом спектрофотометрии показали следующее. Можно сказать, что для Cladonia fimbriata метод микрокристаллизации не подходит для корректной оценки содержания фумарпротоцетраровой кислоты, что может быть связано с низкой концентрацией вторичного метаболита и наличием обильных соредий, которые могли помешать как микрокристаллизации, так и спектрофотометрии. Для Evernia mesomorpha данные по обоим методам анализа сопоставимы. У E. prunastri содержание атранорина и усниновой кислоты можно достоверно оценить любым изученным нами методом, а содержание эверновой кислоты совпадает лишь на 75 %. Для Hypogymnia physodes точность метода микрокристаллизации составляет 83 % у физодаловой кислоты, а у атранорина всего 66 %, что касается салациновой кислоты и атранорина у Parmelia sulcata, то здесь она всего лишь 56 %, для Physconia enteroxantha метод микрокристаллизации показывает точность в 73 %, а у Xanthoria parietina – 75 %.

Разберём влияние типа сообществ и рельефа на концентрацию лишайниковых веществ. Оказалось, что содержание фумарпротоцетраровой кислоты в Cladonia fimbriata в березняках в 4 раза превышает таковое в дубравах и сосняках независимо от рельефа. Скорее всего, это связано с гидрофобными свойствами данного лишайникового вещества [2], что даёт Cladonia fimbriata преимущество при произрастании в мезогигрофитных условиях березняков, по сравнению с мезофитными и ксеромезофитными условиями в дубравах и сосняках соответственно.

В связи с тем, что Evernia mesomorpha, Evernia prunastri и Xanthoria parietina были нами обнаружены только в одном типе сообществ (сосняках, дубравах и осинниках соответственно), то не прослеживается зависимость накопления содержания вторичных метаболитов лишайников от лесной формации для данных видов, однако, мы можем уверенно сказать, что положение в рельефе также не оказывает влияния. Наибольшее количество вторичных метаболитов в Hypogymnia physodes накапливается в дубравах, что может быть связано с нехарактерным субстратом в виде коры дуба черешчатого для данного вида лишайника [8]. Отметим, что при произрастании Hypogymnia physodes в сосняках, независимо от рельефа, накапливается в 2–8 раз больше лишайниковых веществ, чем в березняках, что может быть также связано с особенностями лишайника при произрастании на разном субстрате, хотя и схожем по кислотности, так как кора берёзы повислой для данного вида является наиболее характерным типом субстрата [8]. У Parmelia sulcata можно выявить влияние лишь осинников на накопление атранорина и салациновой кислоты, несмотря на положение в рельефе – концентрация данных веществ в березняках, дубравах и сосняках в
1,5 – 4,3 раза превышает, чем в осинниках. Это, вероятно, связано с близкими значениями кислотности коры берёзы повислой, дуба черешчатого и сосны обыкновенной (pH = 3,7 – 5,4), в отличие от осины (pH = 5,6 – 6,4) [8]. У Physconia enteroxantha выявляется тенденция большего накопления секалоновой кислоты А в дубравах, по сравнению с березняками и осинниками, хотя разница по абсолютному значению невелика. Скорее всего, это результат специфической реакции на нехарактерный для неё субстрат в виде коры осины и берёзы повислой.

Рассматривая двухфакторный дисперсионный анализ без повторений для Cladonia fimbriata, Hypogymnia physodes, Parmelia sulcata и Physconia enteroxantha, мы можем сказать, что тип сообщества достоверно влияет на накопление лишайниковых веществ, кроме Physconia enteroxantha, а положение в рельефе не выявило никакой зависимости (таблица 1).

 

Таблица 1

Результаты данных двухфакторного дисперсионного анализа без повторений для некоторых видов в зависимости от типа сообщества и положения в рельефе

Вид лишайника	Вторичные метаболиты лишайника	Тип сообщества	Рельеф
Cladonia fimbriata	Фумарпротоцетраровая кислота	+	–

Продолжение таблицы 1

Вид лишайника	Вторичные метаболиты лишайника	Тип сообщества	Рельеф
Hypogymnia physodes	Атранорин	+	–
Hypogymnia physodes	Физодаловая кислота	+	–
Parmelia sulcata	Атранорин	+	–
Parmelia sulcata	Салациновая кислота	+	–
Physconia enteroxantha	Секалоновая кислота А	–	–

 

Заключение

Для Cladonia fimbriata метод микрокристаллизации не подходит для корректной оценки содержания фумарпротоцетраровой кислоты, для Evernia mesomorpha данные по обоим методам анализа сопоставимы. У E. prunastri содержание атранорина и усниновой кислоты можно достоверно оценить любым методом, а содержание эверновой кислоты совпадает лишь на 75 %, точность метода микрокристаллизации для Hypogymnia physodes составляет 83 % у физодаловой кислоты, а у атранорина – 66 %, для салациновой кислоты и атранорина у Parmelia sulcata – 56 %, для Physconia enteroxantha – 73 %, а у Xanthoria parietina – 75 %.

Содержание фумарпротоцетраровой кислоты в Cladonia fimbriata в березняках в 4 раза превышает таковое в дубравах и сосняках независимо от рельефа. Наибольшее количество вторичных метаболитов в Hypogymnia physodes накапливается в дубравах; при произрастании в сосняках независимо от рельефа – в 2–8 раз больше, чем в березняках. У Parmelia sulcata содержание атранорина и салациновой кислоты в березняках, дубравах и сосняках в 1,5 – 4,3 раза больше, чем в осинниках. У Physconia enteroxantha выявляется тенденция большего накопления секалоновой кислоты А в дубравах. Двухфакторный дисперсионный анализ без повторений для Cladonia fimbriata, Hypogymnia physodes, Parmelia sulcata и Physconia enteroxantha показал, что тип сообщества достоверно влияет на накопление лишайниковых веществ, кроме Physconia enteroxantha, а положение в рельефе не выявило никакой зависимости.

About the authors

Anastasia Pavlovna Kasyanova

Самарский национальный исследовательский университет имени академика С.П. Королёва

Author for correspondence.
Email: anastasiakasyanova22@mail.ru
Russian Federation

Eugeny Sergeevich Korchikov

Samara University

Email: evkor@inbox.ru
443086, Russia, Samara, Moskovskoye Shosse, 34

References

Supplementary files