INFLUENCE OF EXPERIMENTAL CONDITIONS ON GENOTOXICITY BENZOTRIAZOLE

Full Text

Многие соединения антропогенной природы обладают ярко выраженным генотоксичным эффектом, который проявляется двояко: на уровне хранения генетической информации, вызывая мутации самого различного типа, и на уровне экспрессии генов, изменяя время и место работы гена, а также модифицируя продукты их работы. Как правило, все исследования ведутся в лабораторных условиях, используя стандартный набор скрининг-тестов, которые позволяют выявить генотоксичность, влияющую только на хранение генетического материала и не позволяющие понять сопряжённый ответ нескольких факторов, которые, возможно, имеют эпигенетические проявления. Именно поэтому исследования, позволяющие выявить не только мутагенный ответ, но и обнаружить факторы, вызывающие эпигенетический ответ, приводящие как к появлению фенокопий различных мутаций, так и к увеличению числа мутаций, становятся всё более актуальными. Особый интерес в этом отношении вызывает время и продолжительность воздействия генотоксикантом, приводящим к появлению мутаций. Бензотриазол (азимидобензол) относится к классу гетероароматических соединений, в молекуле которых конденсированы бензольный и азольный циклы, относится к девятичленному гетероциклическому азолу, имеющему три атома азота в пятичленном сопряжённом кольце. Многие производные бензотриазола способны влиять на рост растений, так как бензотриазол и его производные имеют структурное сходство с цитокинами. Цитокины принимают участие в регуляции деления клеток, действуя на их переход из стадии G1 в митоз и уменьшают проницаемость мембран [1]. Выявлена связь между биологической активностью (токсичность, цитотоксичность и мутагенность) и липофильностью, величинами энергии гидратации и дипольного момента бензотриазолов для Allium cepa [2]. Целью нашего исследования было выявление токсичности, цитотоксичности, мутагенности спиртовых растворов бензо-триазола разных концентраций на Allium fistulosum, а также выявление влияния бензотриазола в концентрации 0,001 мг/мл при разных режимах воздействия на исследуемый объект. Условия и методы исследования 1. Методика анализа генотоксичности бензотриазола при его прямом воздействии на Allium fistulosum. Тест-объектом для изучения цитогенетической активности бензотриазола являлась меристема корней Allium fistulosum. В эксперименте использовали семена Allium fistulosum сорта «Нежность». Семена помещали в чашки Петри на 5 суток на фильтровальную бумагу, пропитанную спиртовыми растворами бензотриазола в концентрации 0,001 и 0,0001 мг/мл. В качестве растворителя использовали 5 % изопропиловый спирт. Контролем служили семена, пророщенные в растворителе. Анализировали влияние бензотриазола на всхожесть, длину корней на пятый день роста, на величину митотического индекса в клетках корневой меристемы, на относительную продолжительность фаз митоза, а также на способность индуцировать хромосомные аберрации. Достоверность различий между опытом и контролем оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа [3]. Результаты считали достоверными при P < 0,05. 2. Методика выявления генотоксичности бензотриазола при разных режимах воздействия. Были проведены две серии экспериментов. 1 серия. Семена A. fistulosum были помещены на трое суток в чашки Петри на фильтровальную бумагу, пропитанную растворителем, затем семена переносились в чашки Петри на двое суток, фильтровальная бумага в которых была пропитана спиртовым раствором бензотриазола в концентрации 0,001 мг/мл. 2 серия. Семена A. fistulosum были помещены на трое суток в чашки Петри на фильтровальную бумагу, пропитанную спиртовым раствором бензотриазола в концентрации 0,001 мг/мл, после чего переносились в чашки Петри на фильтровальную бумагу с растворителем на двое суток. Контролем в обеих сериях служили семена, которые в течение пяти суток проращивали в растворителе. Длину корешков и в опыте, и в контроле измеряли каждый день в течение пяти суток. Срезание корешков с дальнейшим микроскопированием, как в опыте, так и в контроле проводили на пятые сутки. Токсичность оценивали по всхожести семян в опыте и контроле, длине корней на пятый день роста. Цитотоксичность оценивалась по способности влиять на величину митотического индекса и на относительную продолжительность фаз митоза. Мутагенность оценивали с помощью ана-телофазного анализа. Достоверность различий между результатами различного режима воздействия бензотриазола на исследуемый тест-объект оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа [3], а также с помощью критерия хи-квадрат [4]. Результаты считали достоверными при P < 0,05. Результаты и их обсуждение Проведённые исследования показали, что бензотриазол в концентрациях 0,0001 и 0,001 мг/мл оказывает ингибирующее действие на всхожесть семян и рост корней проростков A. fistulosum. Наблюдалось снижение всхожести семян на 5,5 % в растворе с концентрацией 0,0001 мг/мл и на 7,0 % в растворе концентрацией 0,001 мг/мл. Происходило уменьшение длины корней на пятый день роста корешков на 28,8 % в растворе с концентрацией 0,0001 мг/мл и на 12,2 % с концентрацией раствора 0,001 мг/мл. Проведённый однофакторный дисперсионный анализ позволил определить коэффициенты дисперсии 6,8 и 0,11, что показывает достоверность результатов отличий на уровне значимости p < 0,01 и p < 0,001 соответственно. Ингибирование ростового процесса спиртовыми растворами бензотриазола 0,001 и 0,0001 мг/мл отразилось в его влиянии на пролиферативную активность клеток меристемы (рис. 1). С ростом концентрации растёт цитотоксичность бензотриазола, что выражается в снижении величины митотического индекса (рис. 1). В обеих концентрациях бензотриазол вызывает остановку митоза на стадии метафазы и анафазы (рис. 2). По мнению Алова и др. [5], вещества, действующие подобным образом, способны влиять на метаболизм пуринов и белков-предшественников нитей веретена деления. Рис. 1. Влияние спиртовых растворов бензотриазола на величину митотического индекса в клетках меристемы A. fistulosum Рис. 2. Влияние бензотриазола на относительную продолжительность фаз митоза в клетках меристемы A. fistulosum Известно, что точки контроля клеточного цикла (checkpoints) способны задерживать клетку до завершения митоза в зависимости от того, что воздействует на конкретную точку контроля. Переход из одной стадии митоза в другую регулируется циклинами. В зависи-мости от того, как циклины связываются с протеин-зависимыми киназами, выделяют точки управления - checkpoints. В этих точках белки-регуляторы - CDK - связываются с предшественниками нитей веретена деления, задерживая последние стадии митоза [6; 7]. Ранее было показано, что пурины способны связываться с кислыми белками, а к таковым относятся и белки, контролирующие целостность веретена деления [8]. Можно предположить, что бензотриазол, выступая структурным аналогом пуринов, также способен связываться с белками-регуляторами клеточного цикла. Рассмотрим влияние различных режимов воздействия бензотриазола на его токсичность (рис. 3, 4). Рис. 3. Влияние разных типов воздействия бензотриазола на пролиферативную активность корневой меристемы A. fistulosum Рис. 4. Влияние разных способов воздействия бензотриазола на относительную продолжительность фаз митоза корневой меристемы A. fistulosum Анализ данных показал, что бензотриазол достоверно ингибирует пролиферативную активность (р < 0,05) (рис.3). Воздействие бензотриазолом после роста лука в растворителе, вызывает более сильный токсический ответ. Скорее всего, это связано с большим количеством делящихся клеток, готовых к воздействию генотоксикантом. Если семена проращивали в бензотриазоле, а потом переносили в растворитель, то блок был обнаружен на стадии анафазы. Если же семена проращивали сначала в растворителе, а потом переносили в бензотриазол, то блоки возникали на стадии профазы (рис. 4). Различия в митотических блоках при различных режимах воздействия бензотриазола говорит о том, что цитотоксичность бензотриазола сильно зависит от того, на какой стадии роста корня A.fistulosum происходит это воздействие. Возможно, митотическая активность корневой меристемы лука имеет волновую зависимость, как это описано для некоторых типов тканей животных, и воздействие бензотриазолом после двух суток прорастания семян в растворителе попало на пик митотической активности [5]. а б в Рис. 5. Хромосомные аберрации в клетках корневой меристемы A. fistulosum после воздействия бензотриазолом: а - отставание хромосом, б - обломки хромосом, в - простой мост Рис. 6. Мутагенная активность бензотриазола при его различных способах воздействия на клетки корневой меристемы A. fistulosum Биологический ответ, вызванный различными способами воздействия бензотриазола, отражается в его способности индуцировать хромосомные аберрации. В опыте и контроле обнаруживаются различия в хромосомных аберрациях. Если в опыте обнаруживается «отставание хромосом» и «мосты», то в контроле мы выявили все типы хромосомных аберраций: «мосты» простые и двойные, «обломки» и «фрагментации» хромосом. Наиболее часто встречающиеся аберрации представлены на рис. 5. Сравнение разных условий влияния бензотриазола на процессы прорастания и развития корневой меристемы A. fistulosum показало, что число хромосомных аберраций зависит от стадии развития данного растения и времени действия токсиканта. На количество хромосомных аберраций влияют способы воздействия генотоксикантов. Так, воздействие бензотриазола в течение пяти суток вызывает только 14,3 % хромосомных аберраций. Когда бензотриазолом воздействовали двое суток после проращивания семян в растворителе число хромосомных аберраций было достоверно меньше - 7,7 %. При воздействии бензотриазолом в первые трое суток, а потом прекращение этого воздействия приводило к максимальному индуцированию патологий митоза, в результате мы зафиксировали 23,7 % хромосомных аберраций. Интересно отметить, что именно при таком сочетании было обнаружено увеличение митотического индекса. Заключение Бензотриазол в изученных концентрациях 0,001 и 0,0001 мг/л выступает как генотоксикант, снижая митотическую активность в корневой меристеме A. fistulo-sum, вызывая блоки митоза на стадии метафазы и анафазы, что выражается в ингибировании процессов роста и всхожести семян лука. Чем выше концентрация бензотриазола, тем более выражен биологический ответ. Бензотриазол в концентрации 0,001 мг/мл снижает всхожесть семян и уменьшает рост корней лука в обеих сериях эксперимента на 5,5 %. Воздействие бензотриазолом после роста лука в растворителе вызывает более сильный токсический ответ. Влияние способа воздействия бензотриазолом наиболее заметно проявляется на клеточном уровне, вызывая ингибирование пролиферативной активности, индуцируя блоки митоза либо на стадии профазы (растворитель + бензотриазол), либо на стадии анафазы (бензотриазол + растворитель). Бензотриазол достоверно индуцирует хромосомные аберрации в клетках корневой меристемы A. fistulosum. Число хромосомных аберраций зависит от экспериментального способа воздействия бензотриазолом на семена A. fistulosum.

About the authors

Mariya Sergeevna Zemskova

Samara University

Email: agneshka-kowalski@yandex.ru
443086, Russia, Samara, Moskovskoye Shosse, 34

References

Supplementary files